Target ID und Validierung

 

Evotec verfügt über eine weltweit führende Plattform zur Förderung der Erforschung, Identifizierung und Validierung innovativer krankheitsmodifiziernder Zielstrukturen („Targets“) in verschiedenen Therapiebereichen sowie zur Unterstützung der Dekonvolution von Zielstrukturen infolge phänotypischer Screenings.

Zu unseren Kompetenzen bei der Identifizierung und Validierung von Targets zählen:

  • Differenzielles Gen-Expressions-Profiling über Zellen und Gewebe hinweg, gefolgt von Bioinformatik-getriebener Datensammlungen, Dateninterpretation und Hypothesenerstellung
  • In vitro-/in vivo-Gene Knock-out- und Überexpressionsstudien und Zugang zu relevanten in vivo-Krankheitsmodellen
  • Erstklassige Plattform für ex vivo-Bildgebung, auf der mithilfe von Gewebeschnitten zelluläre und molekulare Vorgänge erforscht werden können
  • Phänotypische Screenings unter Nutzung komplexer Zellsysteme um Krankheiten zu imitieren
  • Proteomikbasierte Target-Dekonvolution

Genexpressionsanalyse

Die Genaktivität wird sehr genau und höchst dynamisch in Zellen, Geweben oder ganzen Organismen reguliert. Die Beobachtung von Veränderungen bei der Genexpression kann wertvolle Einblicke in die Physiologie, den Krankheitszustand oder die Wirkmechanismen in einem biologischen System geben. Mithilfe der Analyse von Genexpressionsdaten wird der gesamte Wirkstoffforschungsprozess unterstützt – von der frühen Target-Identifizierung bis hin zu Studien über Wirkungsweisen und die Identifizierung von Biomarkern.

Transkriptomik Plattform

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Zu den wichtigsten Aktivitäten gehören:

  • Design und Durchführung von in vitro- oder in vivo-Transkriptomik-Studien unter Auswahl der für die Fragestellung am besten geeigneten Technologie. Evotec bedient sich regelmäßig vielfältiger Methoden – von der Beobachtung einzelner Gene in Hochdurchsatzscreenings mit zielgerichteten Ansätzen bis hin zu Gesamt-Transkriptom-Methoden wie der RNA-Sequenzierung
  • Analyse der differenziellen Genexpression mithilfe der Bioinformatik: Ein Team erfahrener Bioinformatiker untersucht mittels einer Analyse der Rohdaten aus Transkriptomik-Studien regelmäßig die differenzielle Genexpression, den Behandlungspfad und die Wechselwirkungen und ermöglicht so aussagefähige biologische Einblicke
  • Umfangreiche Erfahrung mit den wesentlichen Repositorien von Expressionsdaten und -signaturen ist vorhanden.  Je nach Bedarf führen wir auch auf das Projekt zugeschnittene in silico-Workflows durch, z. B. Meta-Analysen oder die Integration von Transkriptomik-Daten und Daten aus der prädiktiven Pharmakologie

Datenverarbeitungs- und -analysetools

Für die Analyse von großen Datensätzen aus der RNA-Tiefen-Sequenzierung hat Evotec eine leistungsstarke und nutzerfreundliche Datenanalyse-Plattform entwickelt. Auf der Grundlage von Algorithmen, die von Experten überprüft wurden, ermöglicht die Transkriptomik-Plattform von Evotec den Wissenschaftlern, interaktiv mit Genexpressionsdaten zu arbeiten und modernste statistische und Anwendungs-Tools einzusetzen.

Kompetenz bei in vitro Targetmodulation

Evotec bietet eine Vielzahl von Ansätzen an, die prinzipiell auf Liefersystemen von Adeno-assoziierten Viren und Lentiviren für die in vitro-Targetmodulation, einschließlich der leistungsstarken CRISPR-Technologie, basieren. Diese genetischen Werkzeuge ermöglichen die Targetmanipulation in einem breiten Spektrum krankheitsbezogener Modelle und können mit einer großen Auswahl an relevanten Auslesungen („Read-outs“) gekoppelt werden. Evotec nutzt die Genome Editing-Technologie CRISPR-Cas9 mit Lizenzen von ERS Genomics und dem Broad Institute.

Target Identifizierung

Die genetische Screening-Plattform von Evotec setzt ein genomweites CRISPR- und shRNA-Screening ein, um die Target-Identifizierung in einer Vielzahl von Zellsystemen zu unterstützen. Ein gebündeltes, geordnetes Screening in Verbindung mit relevanten Read-outs zielt auf eine Zerlegung komplexer biologischer Phänotypen. Eine integrierte Bioinformatik-Pipeline ermöglicht die Identifizierung relevanter Hits und der biologischen Annotation.

Target Dekonvolution

Bei der Identifikation relevanter Targets aus den Hits phänotypischer Screenings erlaubt die CRISPR-Technologie die Bewertung des Beitrags jedes Gens im Genom zur Aktivität der Substanz. Dies bietet eine Breitspektrumanalyse der Wirkstoffbiologie sowie eine Identifizierung direkter Wirkstoffkandidaten.

Target Validierung

CRISPR und verwandte Technologien bieten direkte Lösungen für die Target-Validierung. Evotec bietet grundlegende „loss-of-function“- und Überexpressionsmodelle sowie aufwendigere Ansätze zur Genomveränderung in krankheitsrelevanten Modellen an. Diese beinhalten primäre Zellen und aus iPS gewonnene Systeme zur Bestätigung des Beitrags einer Zielstruktur zum Phänotyp einer Erkrankung.

In vivo Target Validierung

Zielstrukturen, die aus krankheitsrelevanten Tiermodellen, genetischen in vitro-Experimenten oder aus frei zugänglichen Quellen stammen, erfordern eine gründliche Validierung und Bestätigung. Diese sollte idealerweise vor dem Beginn der Erforschung der niedermolekularen Verbindungen erfolgen. Evotec hat eine Reihe von in vivo- und ex vivo-Modellen für zahlreiche therapeutische Indikationen entwickelt, mit deren Hilfe diese Fragen beantwortet werden können.

Target-Bindung und Modulation mit niedermolekularen Verbindungen oder Antikörpern

Mit vielfältigen Techniken, die von der Mikrodialyse bis zu pharmakodynamischen Modellen mit der Detektion von Biomarkern und der RNA-Expressionsanalyse reichen, zielt Evotec darauf ab, frühzeitig die physiologische Funktion der Zielstruktur in der Krankheitsbiologie zu zeigen. Dieses umfasst eine Reihe von Zielpunkten wie das Monitoring sekretierter Faktoren, Elektrophysiologie von Abschnitten  oder die Modulation einer Signalkaskade.

In vivo-Knockdown-Experimente

Wenn keine geeigneten Hilfs-Substanzen vorhanden sind, werden regelmäßig alternative genetische Ansätze verfolgt, zu denen die stereotatische Erzeugung  von AAV-shRNA gehört, um die in vivo-Expressionsstufen und die Aktivität des Wirtsproteins zu modulieren und die Auswirkungen zu untersuchen, die dieses Protein auf die Zellphysiologie und den Fortschritt der Krankheit hat.

Hochdurchsatz-Histologie

Um eine höchstmögliche Effizienz und Robustheit der in vivo-Modulation der Zielstruktur zu erreichen, hat Evotec eine automatisierte Histologie-Plattform eingeführt, mit der die Erfahrung bei der Bildanalyse und Quantifizierung genutzt wird.

Phänotypisches Screening

Die Fähigkeit, niedermolekulare Verbindungen, Biologika oder genetische Targets im Kontext einer Krankheitsbiologie zu studieren kann nur durch ein phänotypisches Screening in einem Krankheits-Setting  wirksam umgesetzt werden.  Vor dem Hintergrund ihrer mehr als 15-jährigen Erfahrung bietet Evotec eine große Auswahl an phänotypischen Assays an, die für Hochdurchsatzscreenings und die Mechanismen von Wirksamkeitsstudien geeignet sind.

Eine Vielzahl von Read-outs

Je nachdem, welcher Mechanismus von Interesse ist, wird vom High-Content-Imaging bis zur Flusszytometrie und ELISA-Formaten das jeweils am besten geeignete Read-out angewandt.

Phänotypisches "Fingerprinting" von humanen Leberzellen

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Krankheitsrelevante in vitro-Modelle

Mit den Target-agnostischen Ansätzen betont Evotec die Krankheitsrelevanz aus Sicht des Zielgewebes und Zellmodells bis zu Stimuli und Read-outs.

Primäre Zellen und iPS-Modelle

Wenn möglich, setzt Evotec primäre Zellen oder Zelllinien ein, die für die zu erforschende Krankheit geeignet sind: über die Implementierung von iPS-Zelllinien und maßgeschneiderte Differenzierungsansätze sowie den Ansatz des „Patienten in der Petrischale“ versucht Evotec die Übertragung auf menschliche Zellen so früh wie möglich anzugehen.

Genetisches Screening

Phänotypisches Screening ermöglicht bei Evotec nicht nur eine Hit-Identifizierung sondern erlaubt durch den Einsatz von genomweiten CRISPR- und shRNA-Bibliotheken:

  • die erneute Identifizierung neuartiger Zielstrukturen
  • die Untersuchung der vermittelnden Wirkung von niedermolekularen Zielstrukturverbindungen

Chemische Proteomik und Target Identifizierung

Wissenschaftler von Evotec sind Pioniere auf dem Gebiet der Anwendung der chemischen Proteomik zur Unterstützung der Target-Dekonvolution biologischer Verbindungen, die aus phänotypischen Screens  hervorgehen. Die Identifizierung zellulärer Targets ist der entscheidende Schritt zur weiteren Wirkstoffoptimierung und -entwicklung.
 Das Cellular Target Profiling™ von Evotec ist eine leistungsstarke Technologie zur Identifizierung spezifischer zellulärer Wirkstoff-Targets in Lysaten aller Zelltypen oder Gewebe.  Das Angebot von Evotec auf dem Gebiet der chemischen Proteomik enthält ferner die Photoaffinitätsmarkierung für eine kovalente Zielstrukturerfassung  in lebenden Zellen.  

  • Die Ansätze in der chemischen Proteomik bei Evotec nutzen die quantitative High-End-Massenspektrometrie, um die spezifischen zellulären Zielstrukturen eines Wirkstoffs zu entdecken und zu verifizieren
  • Das Cellular Target Profiling™ von Evotec legt targetspezifische Dissotiationskonstanten für den untersuchten Wirkstoff und eine Rangfolge gemäß ihrer wahrscheinlichen physiologischen Relevanz fest

Ablauf eines Cellular Target Profiling™ bei Evotec

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  • Die Photoaffinitätsmarkierung von Wirkstoffen unterstützt die Identifizierung der Bindungsstelle bei Protein-Zielstrukturen und -komplexen
  • Unvoreingenommene Target-Identifizierung durch proteomweites Profiling von nativen, endogen exprimierten, post-translational modifizierten Proteinen bei Vorliegen von zellulären Co-Faktoren und Partnern im nativen Komplex
  • Komplementäre Ansätze der chemischen Proteomik können integriert durchgeführt werden
  • Umfassende, nicht auf eine Target-Klasse begrenzte Erfolgsbilanz im Profiling diverser niedermolekularer Verbindungen

In silico Target Identifizierung und Untersuchung der Nutzbarkeit als Wirkstoff

Target Identifizierung

Evotec verwendet branchenübliche Standarddatenbanken für die Wechselwirkungen von Targets, die in Kombination mit anderen „-omik“-Daten dazu verwendet werden können, eine Karte der Target-Wechselwirkungen zu erstellen. Diese Netzwerke können mit unseren prädiktiven Pharmakologie-Tools erheblich verbessert werden.
 Zurzeit werden über 200 Mio. Bioassay-Datenpunkte zum Aufbau von Modellen beschafft. Die Analyse des Behandlungspfads kann der Identifizierung neuer und neuartiger Targets dienen, die eine Krankheitshypothese modulieren können. Solche Ansätze sind bei der Target-Dekonvolution und der Neuausrichtung des Einsatzes von Wirkstoffen elementar.

Untersuchung der Nutzbarkeit als Wirkstoff

Evotec kann strukturbasierte Untersuchungen neuartiger Targets durchführen, um zusätzliche Hintergründe für die Nutzbarkeit als Wirkstoff zu bieten, wenn keine/nur wenige wirkstoffartige Substanzen bekannt sind. Neue 2-D-sequenzbasierte „Umschaltbarkeits-“ Berechnungen, die auf 3-D-Strukturen hochgerechnet wurden, sind erfolgreich zur Prognose allosterischer Stellen für die Modulation, Oberflächen für PPIs und Bindungen monoklonaler Antikörper (mAb) eingesetzt worden.

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