Bioreagenzien

 

Evotec ermöglicht den Zugang zu einem umfassenden Leistungs- und Kompetenzportfolio rund um die Zell- und Proteinproduktion. Dieses kann individuell oder als integrierter Teil eines größeren gemeinsamen Forschungsprogramms, das auf unsere Wirkstoffforschungsexpertise zurückgreift, in Anspruch genommen werden.

Durch die Kombination der Expertise in Zellkulturmethoden und Methoden mit der Expertise in Biophysik, funktionalen Assays und Hochdurchsatzscreening, bietet Evotec eine flexible und effiziente Plattform für eine termingenaue Lieferung hochwertiger Forschungs-Reagenzien.

Zelllinienentwicklung

Evotec bietet die Entwicklung stabiler Zelllinien nach den individuellen Bedürfnissen der Kunden. Es werden rekombinante Zelllinien hergestellt, die entweder durch stabile Transfektion oder virale Transduktion generiert werden. Durch Einsatz hochstabiler Klone steht ein breites Spektrum an Target-Expressionsstufen und Co-Expressionen mehrerer Untereinheiten  zur Verfügung.
Alle Zelllinien werden mithilfe von Immunofluoreszenz-Markierung, Western Blot oder RT-PCR und weiteren validierten zellbasierten Assays gescreent, um die funktionale Expression des Target-Proteins zu bestätigen.

Zelllinienentwicklung bei Evotec

Die Kompetenzen in der Zelllinienentwicklung umfassen:

  • maßgeschneiderte Expressionsstrategien und Vektorentwicklung
  • konstitutive oder induzierbare Target-Expression
  • durch Target oder Reportergen vermittelte Expression
  • polycistronische oder unabhängige Co-Expression von Hilfsfaktoren
  • mehrere Untereinheiten und Resistenzmarker

Membranvorbereitung

Evotec bietet eine Membranvorbereitung in großen Mengen und verschiedenen Reinheitsgraden z. B. für Ligandenbindungsassays oder in vitro Assays zur Transporteraktivität an. Die Produktion von Zellmembranen kann als individuelle Leistung oder als integrierter Teil eines größeren gemeinsamen Forschungsprogramms in Anspruch genommen werden.

Membranen werden in hoher Qualität durch behutsame Methoden der Zelldisruption gewonnen. Aliquote werden auf die jeweiligen Anforderungen des Kundenprojekts zugeschnitten. Die Membranfunktion wird systematisch durch ein Ligandenbindungsassay validiert:

  • Vorbereitung von Zellmembranen aus transfiszierten Zellen, stabilen Zelllinien, primären Zellen oder Geweben
  • Vorbereitung großer Mengen von bis zu 10 Mrd. Zellen pro Charge
  • behutsame und höchst effiziente Zelldisruption durch Stickstoffdekompression unter Verwendung verschiedener moderner Zellaufschluss-Geräte (z. B. PARR-Bomb® oder Mikro-Fluidisator )
  • Anreicherung von Membranen durch differenzielle Ultrazentrifugation
  • Qualitätskontrolle durch Western Blot und Ligandenbindungsassay

Membranen (N=69 Projekte)

Validierung von Membranen durch Radioligand-Bindungs-Assays:
  • Filterbindungsassay oder Szintillationsnähenachweis (SPA)
  • Sättigungs-Bindung (Bmax, Kd), kinetische Bindung (Koff), konkurrierende Bindung (EC50)
  • Screening von Agonisten, Antagonisten und allosterischen Modulatoren

"Assay-Ready-Frozen Cells"

Das Zellkulturteam von Evotec verfügt über langjährige Erfahrungen bei der Herstellung von „Assay-Ready-Frozen Cells“ für führende Pharma- und Biotechnologieunternehmen. "Frozen Cells" werden als individuelle Leistung oder als integrierter Teil eines größeren gemeinsamen Forschungsprogramms angeboten.
"Frozen Cells" werden in großen Mengen von bis zu 10 Mrd. Zellen pro Charge hergestellt, mithilfe von funktionellen, zellbasierten Assays validiert und in maßgeschneidertem Formatbereitgestellt (z.B. in Platten, Ampullen, Röhrchen oder Tüten).

"Frozen-Cell" Service Angebot:

  • "Assay-Ready-Frozen Cells" aus transfizierten Zellen, stabilen Zelllinien oder Primärzellen
  • Massenproduktion von Suspensions- oder adhärenten Zellen in Screening Chargen
  • sorgfältig überwachte Zellexpansion in CellStacks® oder Bioreaktoren
  • behutsame Ernte der Zellen ohne Beeinträchtigung der Target Pharmakologie
  • automatisierte Abfüllung der Zellen in Kryoröhrchen mithilfe der Fill-It®-Technologie
  • kontrolliertes Einfrieren von Zellen im CryoMed®
  • funktionelle Kontrolle von "Assay-Ready-Frozen-Cells" in zellbasierten Assays

Transiente Transfektionen im Großmaßstab

Für kritische Targets, die sich in Säugetierzellen nicht stabil exprimieren lassen, bietet Evotec transiente Transfektionen im Großmaßstab an.
Unsere Expertise umfasst eine Vielzahl von Transfektionstechnologien, darunter lipidbasierte und viral vermittelte Transfektion von DNS in Zellen, um beispielsweise eine transiente Expression toxischer oder komplexer Targets zu erreichen. Transiente Transfektion ermöglicht  die Herstellung zellbasierter Reagenzien in großen Mengen mit einem hohen Target-Protein Expressionsniveau.

Expertise bei transienten Transfektionen im Großmaßstab

Skalierbare transiente Transfektion durch Elektroporation mithilfe der MAXCYTE® STX-Technologie
  • hocheffiziente Transfektion von bis zu 10 Mrd. Zellen pro Charge
  • gleichzeitige Co-Transfektion mehrerer Untereinheiten, Hilfsfaktoren  oder Reportergen Konstrukte
  • modulierbare Expressionsniveaus für funktionelle zellbasierte Assays oder Proteinexpression mit hohen Erträgen
  • nachgelagerte Verarbeitung transfizierter Zellen zu "Assay-Ready-Frozen-Cells", Membranpräparation oder Proteinreingung

Globale Zellbank-Dienstleistung

An allen europäischen und amerikanischen Standorten bietet Evotec die Einlagerung von Zelllinien unserer Kunden in Zellbanken an.
Neben der Dokumentation und Lagerung der Zelllinien umfasst das Servicepaket auch die Zellexpansion und den Trockeneisversand zu den Standorten unserer Partner.

Die Zellbank-Dienstleistungen von Evotec beinhalten:

  • Dokumentation in Datenbank
  • Zellexpansion unter kontrollierten Kulturbedingungen
  • behutsame Methoden zur Entnahme von Zellen, um die Target Aktivität zu erhalten
  • individuell auf die Assay Bedürfnisse zugeschnittene Zelldichte
  • automatisierte Verteilung der Zellen auf Röhrchen
  • kontrollierte Tiefkühlung und Lagerung der Zellen in der Gasphase von flüssigem Stickstoff

Dieser optimierte Prozess stellt eine möglichst kurze Zeitspanne zwischen der Zellernte und dem Einfrieren sicher, was für die Qualität von gefrorenen "Assay Ready Frozen Cells" entscheidend ist. Zur Qualitätssicherung werden die hergestellten Zellen regelmäßig auf ihre Funktionalität überprüft.

Gene-to-Protein

Evotec besitzt umfangreiche Erfahrungen in der Bereitstellung rekombinanter Proteine. In Zusammenarbeit mit unseren Kunden, offerieren wir kundenbezogene Lösungen, maßgeschneiderte und modulare Arbeitsabläufe, flexible Produktionsumfänge und Zugang zu einem einzigartigen Portfolio an integrierten internen Technologien, um Projekte kosten- und zeiteffeizient abschließen zu können. Ein Team aus Bioinformatikern, Strukturbiologen und Proteinspezialisten entwickelt Proteinkonstrukte und Produktionsabläufe, die auf individuelle Fragestellungen zugeschnitten sind, wie z. B. Assays, Biophysik, Aktivitätsassays und Strukturbiologie sowie von Tierversuchen.

Optimierungsschritte bei der Entwicklung von Expressionskonstrukten:

  • Bioinformatik-Analysen, inklusive homologie-basierte Modellierung und Vorhersage von Sekundärstrukturen, unter Einsatz hochmoderner Software
  • identifizierung von optimalen Tagging-Strategien, Domänengrenzen und Mutagenesen  
  • Auswahl des Expressionswirts und der gewünschten Zelllokalisierung, z. B. sekretiertes Periplasma
  • Kundenspezifisches Vektordesign

Zahlreiche Expressions-Systeme:

  • E. coli
  • Yeast
  • Baculovirus-infizierte Insektenzellen
  • Säugerzellen
  • Zellfrei

Vom Gen zum Protein (flexible Einstiegspunkte)

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Umfassende Aufreinigungs-Plattform:

  • Mehrere Zellauflösungs-Optionen
  • Proteinreinigungs-Screen und Scale-Up durch Verdünnung/Dialyse
  • Chromatographie, inklusive Affinität, Ionenaustausch, hydrophobe Interaktion und Größenausschluss
  • Endotoxin-Entfernung und Bestätigung durch LAL Assay
  • Übliche Qualitätskontrolle beinhaltet SDS-PAGE, Western Blot, Mass-Spec, dynamische Lichtstreuung, Hoch-Durchsatz analytischer/Fluoreszenz Größenausschluss, Biophysik und Aktivitäts-Assays, sowie SEC-MALLS

Membranproteine

Evotec verfügt über langjährige Erfahrungen auf dem Gebiet der Herstellung von Membranproteinen. Hierbei arbeiten wir mit Prozessen, die zur Hochdurchsatzoptimierung der Expressions- und Solubilisierungsbedingungen sowie die Produktion großer Proteinmengen geeignet sind. Wir liefern in kürzester Zeit hochgradig gereinigte Target-Proteine beispielsweise für Assays, Biophysik und Strukturbiologie.

Baculovirus-infizierte Insektenzellen

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Scouting und Optimierung von Proben:

  • fluoreszenzbasierte „Size Exclusion Chromatography“ (fSEC)
  • automatisierte Affinitätsreinigung im Mikrobereich
  • auf ThermoFluor basierende Stabilitätsassays für membrangebundene und solubilisierte Proteine
  • Radioligand-Bindungs-Assays für membrangebundene und solubilisierte Proteine
  • LCP-FRAP und in situ Screening durch Diamond Light Source, UK

Membran-Proteinproduktion im Großmaßstab:

  • heterologe Proteinexpression in Zellsystemen von Säugetieren, Insekten und Hefe sowie in Bakterien
  • Produktion von virusähnlichen Partikeln (VLPs) und Lipoproteinen
  • erweiterte Membranaufbereitung und -reinigung
  • pharmakologische und biophysikalische Analyse
  • Kristallisierung von Lipiden in der kubischen Phase (LCP), Bizellen  und Dampfdiffusion

Evotec`s Membran Struktur-Pipeline

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Proteinmarkierung für Assays, NMR, SPR und MST

Zu den Markierungsstrategien zählen die Isotopenmarkierung für NMR und Massenspektrometrie, mit Selen-Methionin angereicherte Proteine für die makromolekulare Kristallographie und Biotinylierung für Assays und SPR.

Zudem bietet Evotec die Markierung biologisch relevanter Moleküle und Reagenzien für die Verwendung beispielsweise in ELISA-, FACS- und FCS-Messgeräten. Unsere Leistungen unterstützen unsere Kunden bei der Verbesserung ihrer Forschungsergebnisse bei denen biologische und pharmakologische Assays eingesetzt werden, sowie bei der klinischen Diagnostik, Analytik und Agrochemikalien.

Unsere Erfahrungen umfassen die Markierung folgender Spezies:

  • Peptide und Chemokine (beispielsweise als Enzymsubstrate, GPCR-Liganden, etc.)
  • Gereinigte Proteine einschließlich Antikörper
  • Mutagenese von Proteinen für die ortsspezifische Markierung
  • Glykoproteine
  • Kohlenhydrate

Bei der Markierung verwenden wir die für die Anwendung des Kunden optimal geeigneten Farbstoffe und funktioneller Gruppen wie z. B.:

  • im Handel verfügbare fluoreszierende Farbstoffe und den einlizensierten Farbstoff MR121
  • nicht fluoreszierende Marker wie Affinitätskennzeichen, Biotin und Reporterenzyme 

Hochdurchsatz-Proteinproduktion

Evotec bietet eine Hochdurchsatz-Plattform zur Optimierung der Proteinexpressions- und Aufreinigungsbedingungen an, um eine effiziente Proteinherstellung in E. coli, Baculovirus-infizierten Insektenzellen und Säugetierzelllinien zu erreichen.  Für die Auswahl von Expressionskonstrukten, und die Anpassung des Expressionsumfangs an den finalen Ertrag, bei minimalen Verlusten, werden robuste statistische Modelle angewandt. Die Plattform wurde in den vergangenen zwei Jahren erfolgreich bei über 500 individueller Expressionskonstrukten eingesetzt.

Prozesse einer standardisierten Hochdurchsatz-Proteinproduktion:

  • parallelisiertes Expressions-Scouting von Konstrukten
  • eigene statistische Analyse zur Überprüfung und Priorisierung
  • Expression im großen Maßstab (1-3 Liter)
  • parallelisierte Aufreinigung und Qualitätskontrolle
  • Blöcke von 96 Konstrukten vom "Gen zum Protein" innerhalb von 2-3 Monaten, die für umfangreiche Downstream Experimente eingesetzt werden können

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